Los métodos de recolección de los tardígrados dependen del medio que se esté estudiando (marino, dulcecuícola, muscícola, hojarasca, edáfico, etc.), ya que parte de la biología de los tardígrados varía de unos medios a otros. Sea cual sea el método de recolección y obtención de los tardígrados, éstos han de ser fijados y se deben elaborar preparaciones permanentes, ya que para identificarlos es necesario su observación mediante el microscopio óptico, con el objetivo de inmersión y con contraste de fase. Recolección
En general, sin importar el medio del que procedan las muestras, hay que mantenerlas en agua durante un período de tiempo determinado, para activar a los tardígrados que puedan estar en criptobiosis. Después, hay que recogerlos con un tamiz de luz de malla conocida y suficientemente pequeña como para retener tanto a los tardígrados como a sus huevos (la luz de malla debe estar entre 50 mm y 1,2 mm; Nelson, 1982), y, finalmente, hay que estudiar el material recogido en el tamiz, utilizando una lupa binocular para separar los tardígrados y sus huevos.
Tardígrados marinos
Los tardígrados marinos no son nadadores y necesitan algún tipo de sustrato sobre el que mantenerse; por ello habitan el fondo, el litoral marino u otras superficies sobre las que puedan engancharse (algas, otros invertebrados, etc). El método de recolección de este tipo de tardígrados es el mismo que el utilizado para otros animales bentónicos (Ramazzotti y Maucci, 1983). Se arrastran por el fondo dragas con mallas muy finas donde quedan atrapados los tardígrados de la superficie del fondo y los macrófitos, algas, musgos sumergidos, etc. (Lincoln y Sheals, 1979). Para recoger los tardígrados de las muestras marinas hay que someterlos a un shock con agua dulce que permite separar fácilmente los animales de los sustratos a los que se agarran (Møbjerg y Dahl, 1996). Después hay que lavar y tamizar el material, para separar los tardígrados mediante flotación (Lincoln y Sheals, 1979). Es aconsejable estudiar el material fresco, pues esto facilita la identificación de los animales (Ramazzotti y Maucci, 1983).
Tardígrados dulceacuícolas-intersticiales
Los tardígrados de la fauna intersticial se extraen del agua freática, así que cualquier método utilizado para estudiar la meiofauna intersticial, sirve para los tardígrados: método de Bou-Rouch, (Bou y Rough, 1967), método de Karaman-Chappuis (Karaman, 1935; Chappuis, 1942) y otros (más información sobre la metodología en la revisión de Pospisil, 1992). Estos métodos consisten, a grandes rasgos, en excavar un agujero cerca de una masa de agua (río, lago, arroyo, etc.) y extraer una determinada cantidad de agua, que después hay que tamizar y estudiar (Ramazzotti y Maucci, 1983). Esto tiene dos desventajas: (1) tiene un efecto selectivo sobre los tardígrados recolectados, ya que es más fácil arrastrar a los individuos juveniles a través de los granos de arena que a los de mayor tamaño, y (2) para asegurarse un muestreo representativo hay que tomar mucha cantidad de agua, con el enorme esfuerzo que ello implica, tanto en la recolección del material, como en su estudio (Ramazzotti y Maucci, 1983). Al igual que en la observación de los tardígrados marinos es aconsejable identificar el material fresco porque es más sencillo (Ramazzotti y Maucci, 1983).
Tardígrados muscícolas
La recolección de musgos, líquenes, hepáticas, herbáceas, etc., donde pueden encontrarse tardígrados, consiste en separarlos de su sustrato e introducirlos en un sobre de papel o similar, para evitar la humedad, de forma que pueda quedar almacenado el tiempo necesario (Ramazzotti y Maucci, 1983). No es aconsejable el uso de bolsas de plástico, ya que cualquier rastro de humedad favorecerá la aparición de hongos y/o la putrefacción de la muestra. Si el material recolectado está muy húmedo y no se va a examinar en breve, hay que secarlo (mediante una estufa o con papel secante) y una vez seco se almacena en sobres de papel hasta su estudio (Ramazzotti y Maucci, 1983). Para la obtención de los tardígrados se pone la muestra, fresca del campo o previamente secada, en un recipiente con agua durante varias horas para revertir la anhidrobiosis. La muestra se lava con agua del grifo y se escurre para recoger los animales, los huevos y los quistes en un tamiz de luz de malla conocida y suficientemente pequeña (Kinchin, 1987; Nelson, 1991a). Para el estudio de musgos, y otros medios, localizados en zonas con agua constante (arroyos, surgencias, etc.), se guarda el material en una botella o en un tubo, con agua del lugar donde se ha recolectado. Este material se debe examinar lo antes posible, ya que los tardígrados de estos medios están desprovistos de la capacidad de entrar en criptobiosis. En caso de que su estudio no pueda ser inmediato, se lava y escurre el material al máximo (se debe vigilar, mediante la observación con lupa, que no queden tardígrados en el material) y se fija con formalina neutralizada o con Bouin diluido (Ramazzotti y Maucci, 1983).
Tardígrados edáficos y de hojarasca
Las muestras de suelo se pueden recoger con un tubo metálico (u otra estructura) de material resistente y de bordes afilados, para clavarlo en el suelo (Ramazzotti y Maucci, 1983). El cilindro de arena contenido en el tubo se saca con una varilla. Puesto que el tubo metálico tiene dimensiones conocidas se pueden realizar estudios cuantitativos. Como en los otros casos, es mejor estudiar el material lo antes posible, pero si no va a hacerse de inmediato, se guarda en bolsas de papel. Hallas y Yeates (1972) modificaron las técnicas de extracción de nematodos del suelo, mediante centrifugación en agua con sacarosa, para recolectar los tardígrados edáficos. La recolección de hojarasca de los estratos más superficiales donde pueden encontrarse los tardígrados, hasta los 5-10 cm (Ramazzotti y Maucci, 1983), no requiere ninguna precaución especial. Al igual que en otros casos, la muestra ha de mantenerse seca para evitar que se pudra y/o crezcan hongos. Como en el caso del suelo, para el estudio de los tardígrados que están en hojarasca, se pone la muestra en un recipiente con agua durante unas horas y se tamiza con una luz de malla lo suficientemente pequeña como para recoger los tardígrados y sus huevos (Ramazzotti y Maucci, 1983; Nelson, 1991a).
Coloración
Los distintos colorantes que se utilizan con los tardígrados varían según los objetivos y las estructuras que se quieran estudiar. El rojo neutro se utiliza como colorante vital (Ramazzotti y Maucci, 1983). El azul de metilo produce coloración no selectiva de los músculos y de las fibras nerviosas. Éste se debe usar en soluciones muy diluidas y con cuidado, ya que es un producto venenoso para los tardígrados (Ramazzotti y Maucci, 1983). El carmín acético se usa para la coloración in toto; su efecto se debe seguir al microscopio para evitar una coloración muy intensa, y puede usarse sin haber fijado previamente al animal o al huevo; tiene el inconveniente de que destruye gran parte de los estiletes y las piezas duras (Ramazzotti yMaucci, 1983). El método de Del Rio Hortega, según la técnica usada por May (1948), tiñe selectivamente de marrón a amarillo los órganos y las células, particularmente las fibras nerviosas. La hematoxilina férrica se utiliza como colorante postvital para la observación de las gónadas (Rodríguez Roda, 1952).Fijación
La fijación de los tardígrados acuáticos y terrestres se puede hacer con formalina, a una concentración del 5-10% (Lincoln y Sheals, 1979). La formalina no es el fijador ideal, pero es mejor que, por ejemplo, el alcohol, por no dejar transparentes a los ejemplares. Se debe neutralizar con carbonato de magnesio para evitar que se deshagan las piezas calcáreas (Ramazzotti y Maucci, 1983). Si se va a realizar preparaciones con líquido de Hoyer, no es recomendable fijar con formalina (Nelson, 1991a). El líquido de Bouin diluido también se puede utilizar como fijador y como conservante de tardígrados (Puglia, 1959). Los mejores fijadores para realizar estudios histológicos son el ácido ósmico y el ácido acético al 2% (Ramazzotti y Maucci, 1983). Un desarrollo pormenorizado de la preparación de los tardígrados para este tipo de estudios está detallado en Dewel y Dewel (1996).
Los tardígrados recolectados en musgos, líquenes, hepáticas, etc. se pueden fijar con alcohol 70-80% (Lincoln y Sheals, 1979), con agua hirviendo en pequeñas cantidades (Nelson, 1982; Nelson, 1991a) o con líquido de Carnoy (metanol de 96º y ácido acético puro, en una proporción de 3:1; Bertolani, Rebecchi y Beccaccioli, 1990), que también sirve como conservante (Bertolani y Guidetti, com. pers.). Los tardígrados recolectados de grandes volúmenes de agua se conservan mejor en formalina tamponada (5-10%) o en glutalaldehido (Nelson y Schuster, 1981).
Preparaciones permanentes
Los dos métodos más extendidos para hacer preparaciones permanentes con tardígrados son: con líquido de Faure (50 cc de agua destilada, 50 g de hidrato de cloral, 20 cc de glicerina y 30 g de goma arábiga) o con polivinil lactofenol. Las preparaciones realizadas con el líquido de Faure, y posteriormente selladas, se conservan perfectamente durante mucho tiempo, al menos varias decenas de años (Ramazzotti y Maucci, 1983), aunque pueden aparecer cristalizaciones que dañan las preparaciones. El líquido deFaure conserva bien las preparaciones teñidas previamente con carmín acético (Ramazzotti y Maucci, 1983). El polivinil lactofenol permite una mejor extensión de los animales y conserva mejor las estructuras cuticulares de Eutardigrada respecto a los resultados obtenidos con el líquido de Faure (Ramazzotti y Maucci, 1983). Sin embargo, con este producto pueden aparecer espacios con aire que dañan al tardígrado, pero a diferencia con el líquido de Faure, donde también pueden aparecer espacios con aire, los daños son irrecuperables (Ramazzotti y Maucci, 1983). El polivinil lactofenol también requiere que la preparación sea sellada para su conservación. El medio de Hoyer (50 cc de agua destilada, 30 g de goma arábiga cruda, 150 g de hidrato de cloral, 20 g de glicerina, 1 g de ioduro de potasio, 2 g de yodo; Nelson y Schuster, 1981) deja a los especímenes transparentes y extendidos, pero la preparación se debe sellar para asegurarse de que sea permanente (Nelson y Schuster, 1981; Nelson, 1991a).
Los tardígrados que se vayan a estudiar con el microscopio electrónico de barrido (SEM) se dehidratan sometiéndolos a concentraciones crecientes de alcohol hasta mantenerlos en alcohol absoluto, se transfieren a un líquido intermedio, como el acetato de amilo, y se secan por el método del punto crítico (Grigarick et al., 1975). Los individuos se montan en los stubs para SEM y se les da un baño de oro u oro-paladio (Nelson, 1991a). También podría considerarse una preparación permanente la extracción y purificación del ADN de los ejemplares seleccionados. El desarrollo de metodología para la obtención y estudio del material genético es muy reciente. Algunos de los protocolos para la preparación del material se encuentran en Garagna et al. (1996), Giribet et al. (1996) y Garey et al. (1999), pero generalmente se parte de especímenes vivos, congelados o mantenidos en alcohol.Cría de tardígrados en laboratorio
Desde las primeras tentativas, registradas en 1914 (von Wenck, 1914), hasta nuestros días, sólo se han desarrollado técnicas de cultivo para eutardígrados. No hay publicaciones o registro de experimentos de cultivo de heterotardígrados (Altiero, 2001). Este cultivo no se puede llevar a cabo en su medio natural, ya que es imposible realizar el seguimiento de animales tan pequeños en el mismo (musgos, suelo, líquenes, etc.), mientras que la cría en medio artificial presenta numerosas dificultades (Nelson, 1982; Ramazzotti y Maucci, 1983). El principal requisito previo al cultivo de tardígrados es conocer la alimentación de la especie con la que se quiere trabajar. Sayre (1969) desarrolló un método para cultivar tardígrados depredadores. Este método consiste en cultivar primero nematodos, que luego van a alimentar a los tardígrados. Los nematodos se cultivan en placas Petri a las que se añade avena precocinada y húmeda, con algunos granos de levadura seca. El soporte físico para los nematodos, se obtiene autoclavando Sphagnum molido y lavado con agua desmineralizada. Se trata de ir añadiendo nematodos a medida que los tardígrados se los comen. El método de Sayre se desarrolló para tardígrados del género Isohypsibius, alimentados con nematodos de la especie Panagrellus redivivus. Este método puede adaptarse para otras especies de tardígrados, variando el alimento, según sean bacteriófagos, carnívoros o herbívoro, y añadiendo un papel de filtro humedecido para evitar la desecación (Altiero y Rebecchi, 2001). Altiero (2001) desarrolló un protocolo para el cultivo de una especie carnívora, Macrobiotus richtersi, y una especie herbívora, Diphascon (Adropion) scoticum. Utilizó como sustrato agar (en las placas con la especie carnívora) y algas (en las placas con la especie herbívora), a los que añadió agua mineral embotellada, un papel de filtro húmedo, y los mantuvo a una temperatura entre 14 y 20 ºC, con un fotoperíodo controlado de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. A los ejemplares de la especie carnívora los alimentó con nematodos de las especies Pristionchus iheritieri, Panagrolaimus rigidus o Caenorhabditis elegans, que había criado aparte, y a los individuos de la especie herbívora los alimentó con algas de la especie Scenedesmus acutus, también cultivada aparte. El cultivo de tardígrados ha supuesto y supone un gran avance en el estudio de su biología. Las razones por las que se han cultivado estos organismos son muy variadas, incluyendo estudios del ciclo vital (Marcus, 1929; Kristensen, 1982), sobre el desarrollo embrionario (Dougherty, 1964), sobre el enquistamiento, citológicos y cariológicos (Bertolani y Buonagurelli, 1975; Altiero, 2001), sobre la formación de la cutícula (Crowe et al., 1971), etc.