Criptobiosis en los tardígrados
Los tardígrados se encuentran activos siempre y cuando una película de agua rodee su cuerpo, es decir, son hidrófilos (Nelson, 1982). En momentos de sequía entran en un estado de criptobiosis –anhidrobiosis-, que es una de las características más llamativas de este grupo, y que comparten con otros grupos como, por ejemplo, nematodos y rotíferos (Kinchin, 1987). El primer autor que estudió la criptobiosis en tardígrados fue Spallanzani (1769), quien además anotó la extraordinaria resistencia a condiciones extremas que este estado les confería. Crowe (1971) dividió a los organismos anhidrobióticos en dos grandes grupos (probablemente extensible a la criptobiosis en general; Wright et al., 1992): aquellos con anhidrobiosis en los estados ontogenéticos tempranos (semillas de plantas, esporas de hongos y bacterias, huevos de crustáceos, etc.) y aquellos con anhidrobiosis en cualquier estado de su ciclo vital (protozoos ciliados, rotíferos belloideos y nematodos). En este último grupo se puede incluir la criptobiosis de los tardígrados.
Tipos de criptobiosis en los tardígrados
Según Crowe (1975) hay cinco tipos de estados de latencia o criptobiosis según las condiciones que lo induzcan:
1) Enquistamiento: se desconocen los factores ambientales por los que se desencadena. Es el estado de latencia más común en los tardígrados acuáticos que viven en charcas o estanques permanentes. Antes del enquistamiento, el tardígrado almacena gran cantidad de alimento en las células de la cavidad corporal, expulsa el aparato bucofaríngeo, entra en estado simplex y el intestino se llena de material de desecho. El animal muda, pero se queda dentro de la vieja cutícula en un estado inmóvil y contraído (Nelson y Higgins, 1990). El quiste puede sobrevivir en la naturaleza más de un año sin reducir las reservas de alimento, aunque no puede soportar condiciones tan extremas como en anhidrobiosis (Nelson y Marley, 2000).
2) Anoxibiosis: también se conoce con el nombre de “estado de asfixia” y se induce mediante bajas concentraciones de oxígeno. El tardígrado se hincha por la pérdida del control osmótico, con la subsecuente absorción de agua. El organismo queda extendido, inmóvil y aparentemente muerto. En este estado puede sobrevivir cuatro o cinco días. Reviven al añadir oxígeno (Nelson y Higgins, 1990).
3) Osmobiosis: es un estado de criptobiosis provocado mediante elevadas presiones osmóticas, cuando se somete al animal a concentraciones anormales de sal. Permite a los tardígrados dulceacuícolas sobrevivir cortos períodos de tiempo en agua de mar (Nelson y Higgins, 1990).
4) Criobiosis: son las bajas temperaturas las que fuerzan este estado, permitiendo la supervivencia de los tardígrados tanto en congelación como en el deshielo. El animal contrae la cabeza, las patas y el cuerpo, adoptando la forma de tonel (tun) (Nelson y Higgins, 1990). Parece que los ice nucleating agents (INA), el glicerol y las trehalosas, juegan un papel muy importante, probablemente, como anticongelantes (Wright, 2001).
5) Anhidrobiosis: este estado se alcanza al evaporarse el agua de las muestras con tardígrados terrestres y semiacuáticos. Los animales vuelven a activarse cuando hay agua disponible. La supervivencia de los tardígrados que tienen esta capacidad de entrar en criptobiosis depende de la velocidad o progresión en la evaporación (Nelson y Higgins, 1990).
Proceso de anhidrobiosis en los tardígrados
Para que se inicie el estado de anhidrobiosis, el tardígrado debe estar expuesto a condiciones de sequedad que provoquen la pérdida de agua, que pase de ser de un 85% del peso de su cuerpo a un 3%. Una desecación rápida provoca la muerte del tardígrado, pero si el organismo se seca lentamente (Crowe, 1971), puede revivir añadiéndole algo de agua. En el momento en que cesa el movimiento y se produce la contracción activa del animal (Crowe, 1971), éste toma el aspecto de un tonel (tun) lo que disminuye la tasa de evaporación y protege a los órganos internos de trastornos mecánicos (Crowe, 1975). La adopción de la forma de tonel se produce por la invaginación total de los segmentos cefálicos y las patas y la expulsión de lípidos (Wright, 1988a), lo que puede servir para reducir la transpiración o como protector antifúngico. Tomar la forma de tonel es un requisito vital para el éxito de la anhidrobiosis (Wright et al., 1992). La cutícula de los tardígrados presenta diversas adaptaciones estructurales que facilitan la adopción de esta forma (Wright et al., 1992). Por ejemplo, las regiones intersegmentales de la cutícula se reducen a la mitad, lo que favorece la flexibilidad. Durante esta fase, hay una disminución lineal de la transpiración a medida que el área superficial se reduce (Wright et al., 1992), a diferencia de los animales moribundos que mantienen su transpiración casi constante. Cuando se completa la formación del tonel, la transpiración desciende bruscamente lo que implica una disminución de la permeabilidad de la cutícula (Crowe, 1972). Gracias a que queda cierta permeabilidad residual, el animal puede retener una fracción sustancial de agua libre (Wright et al., 1992). Cuando se vuelve a humedecer la muestra, el tardígrado permanece unos minutos con forma de tonel antes de volver gradualmente a su forma original y recobrar el movimiento (Wright, 1989). Después de una hora de desecación la actividad se recupera entre 10 y 20 minutos después, y tarda de 1 a 2 horas cuando el organismo se mantiene mucho tiempo en estado de anhidrobiosis (Westh y Ramløv, 1991).
Fisiología de la anhidrobiosis en los tardígrados
La pérdida del agua líquida, como consecuencia de la evaporación o de la vitrificación, promueve la formación de una matriz de carbohidratos. Estos carbohidratos parecen ser ubicuos dentro del criptobionte y tienen varias funciones (Wright, 2001): (1) como osmolitos compatibles durante la desecación, (2) como estabilizadores de la estructura cuaternaria de las proteínas y de la integridad de la bicapa lipídica cuando decae la actividad del agua libre y (3) como superanticongelantes. Ante una situación de desecación, las plantas tienden a sintetizar oligosacáridos como estaquinosa y rafinosa, mientras que semillas, esporas y metazoos dependen principalmente de disacáridos como la sacarosa, trehalosa y/o glicerol (Wright, 2001). Estos azúcares forman la matriz de carbohidratos que protege a los organismos durante la desecación. A nivel celular hay que diferenciar entre el agua libre de intercambio intra- o extracelular del agua vicinal, también conocida como agua frontera o agua no congelable (Wright et al., 1992), que está íntimamente asociada a moléculas tales como los fosfolípidos de la membrana, las proteínas y los ácidos nucleicos, formando un componente macromolecular de estructura terciaria. Según la hipótesis de la “sustitución del agua” (Webb, 1965; Crowe, 1971), durante la desecación en el proceso de anhidrobiosis, hay sustitución del agua estructural de los compuestos celulares por compuestos “polihidroxi”. Uno de estos compuestos es el disacárido trehalosa (Westh y Ramlov, 1991), que protege la membrana y las proteínas (de hecho, evita su desnaturalización a altas temperaturas, desecación, variaciones de pH y baja/alta osmolaridad; Ramløvy Westh, 2001) y que, junto con el glicerol, ha demostrado ser uno de los mejores componentes protectores (Wright et al., 1992). Parece que es el grupo hidroxi- del azúcar el que interactúa químicamente con los residuos polares de los componentes celulares (Crowe y Crowe, 2000). Además de la trehalosa, al comienzo de la anhidrobiosis se produce síntesis de novo de una proteína aún sin identificar, pero que pertenece a la familia de las heat-shock proteins (HSP) (Ramløvy Westh, 2001), que es una familia de proteínas que se sintetiza cuando hay estrés (aunque también hay una cierta síntesis en condiciones normales) y cuya función es minimizar los problemas que puedan surgir cuando otras proteínas no tienen conformaciones nativas. La síntesis de trehalosa continúa aún después de adquisición de la forma de tonel y del descenso en la permeabilidad de la cutícula, ya que existe una cierta cantidad de agua retenida que permite que la síntesis metabólica se mantenga (Wright et al., 1992). ¿Qué sucede durante la criptobiosis?, prácticamente nada. El metabolismo, la principal característica de la vida, es casi imperceptible (Crowe, 1971; Nelson, 1995). Al añadir agua, el tardígrado comienza a activarse. Durante el proceso de rehidratación los tardígrados presentan un rápido catabolismo aeróbico de la trehalosa, que se produce en los primeros 12 minutos, por la actividad de la trehalasa pH-dependiente (Wright et al., 1992). La síntesis rápida de trehalosa y su catabolismo pueden ser determinantes en cuanto a la tolerancia del tardígrado a la desecación. Los niveles de desecación que se requieren para alterar la cinética en la síntesis y degradación de trehalosa son muy modestos (Wright, 2001); por lo tanto, no parecen ser un obstáculo en el proceso de anhidrobiosis. Los sustratos metabólicos para la síntesis de trehalosa son, aparentemente, reservas de lípidos y glicógeno (Wright, 2001) y, por tanto, una acumulación de estos sustratos metabólicos antes de la desecación podrían propiciar el éxito en la anhidrobiosis. No sólo el agotamiento de estos sustratos metabólicos pueden limitar la longevidad de los anhidrobiontes, sino también el efecto sobre éstos de los hongos y de otros parásitos (Jönsson y Bertolani, 2001). Parece que los organismos que tienen la capacidad de entrar en anhidrobiosis es frecuente que también sean criobiontes (Wright, 2001), lo que sugiere que entre los mecanismos bioquímicos de ambos procesos existen homologías. En realidad hay tres diferencias fundamentales entre anhidrobiosis y criobiosis (Wright, 2001):
(1) en criobiosis adquirir la forma de tonel no es esencial, a diferencia de lo que ocurre en anhidrobiosis; de hecho, este cambio de forma en criobiosis sólo se ha observado cuando la congelación es lenta (Crowe, 1975),
(2) la tolerancia a la tasa de congelación depende de la capacidad de inhibir la congelación intracelular, mientras que en anhidrobiosis se trata de evitar la desecación intracelular, y
(3) parece que en criobiosis hay catálisis de ice-nucleating agents (INA), en lugar de la síntesis de trehalosa en anhidrobiosis, cuyo valor crioprotector es menor (Wright et al., 1992).
Durante la congelación, el hielo extracelular puede que confiera soporte mecánico a los órganos, lo que sustituiría al cambio de forma necesario durante la anhidrobiosis (Wright et al., 1992). Ambos procesos, anhidrobiosis y criobiosis, entrañan la misma clase de riesgos para los tardígrados: variación rápida de volumen, daño físico derivado de la ausencia de agua o del crecimiento de cristales de hielo en la célula y la desnaturalización de las proteínas por desecación o por la concentración de los electrolitos resultantes (Hochachka y Somero, 1984). En el caso de la congelación, además, puede haber cambio del potencial de membrana y del pH intracelular (Ramløv, 2000). Hasta ahora se discute si los tardígrados durante la criobiosis sufren vitrificación citoplasmática o si la desecación por congelación y la consecuente disminución de la actividad del agua citoplasmática, hacen que el agua que queda no se congele (Wright, 2001). Los defensores de la vitrificación argumentan que los componentes macromoleculares esenciales del citoplasma se protegen al quedar suspendidos dentro de una matriz de elevada viscosidad (Franks, 1985), mientras que los defensores de la desecación por congelación sostienen que en la congelación también hay una acumulación de trehalosa cuya protección celular se explica por la hipótesis de sustitución del agua (Wright, 2001). Para Crowe et al. (1998) no son posturas excluyentes.
Estas hipótesis llegaron a un punto muerto en el que las investigaciones no avanzaban, y sólo una década después se retomaron las líneas de investigación para averiguar cómo se produce la criptobiosis, pero desde la perspectiva molecular. Así, dos grupos en el Mundo están secuenciando el genoma completo de dos especies, el grupo alemán de una especie de Milnesium, y el grupo japonés, de una especie de Ramazzottius, y a partir de ese genoma secuenciado derivar las proteínas implicadas en las criptobiosis. Así, se están descubriendo proteínas nuevas asociadas al proceso de criptobiosis (datos presentados en el 12º Simposio Internacional de Tardigrada, celebrado en Porto, Portugal, en Julio de 2012).
Supervivencia de los criptobiontes (tardígrados en criptobiosis)
El límite de supervivencia de los tardígrados en estado de criptobiosis no está claro. Existe una cita que cifra en 120 años los que puede estar un tardígrado en anhidrobiosis y revivir al añadir agua al medio, pero existen dudas de que en realidad reviviera tras ese período de tiempo (Jönsson y Bertolani, 2001). Las estimas que se han hecho sobre la duración de un ciclo vital completo, para rotíferos, tardígrados y nematodos, incluyendo períodos de criptobiosis, están entre los 7 y los 10 años (Crowe, 1971). La supervivencia entre las distintas especies de tardígrados con capacidad de entrar en criptobiosis no es uniforme. Jonsson, Borsari y Rebecchi (2001) descubrieron que existen diferencias significativas entre la supervivencia de las especies Ramazzottius oberhauseri y Richtersius coronifer, pero no entre las poblaciones de una misma especie. Parece que estas diferencias entre especies pueden representar adaptaciones a las condiciones específicas de un hábitat (Wright, 1991). Un aumento en el tamaño corporal, una reducción en el tamaño de las células de almacenaje (Jönsson, 2001) y el hecho de que los oocitos estén en un avanzado estado de vitelogénesis (Wright, 2001) disminuyen la supervivencia de los tardígrados que entran en criptobiosis. Parece que se trata, en definitiva, de tener suficiente energía de reserva que poder movilizar. Un factor muy importante en la supervivencia de los criptobiontes es la oxidación de los radicales libres, sobre todo a altas temperaturas. Los radicales superóxidos, en particular, son oxidantes muy potentes que pueden ser muy destructivos en los criptobiontes, ya que la actividad de la enzima superóxido dismutasa está reducida (Wright, 2001). Por lo tanto, las condiciones óptimas para la supervivencia de los criptobiontes son aquellas con bajas temperaturas, bajo contenido de agua y bajas concentraciones de oxígeno (Wright, 2001).
Función de la criptobiosis en el filo Tardigrada
La criptobiosis, además de prolongar la vida del tardígrado, juega un papel fundamental en la dispersión y la distribución de los tardígrados por el Mundo (Nelson, 1995). Uno de los efectos de los períodos de anhidrobiosis es su impacto sobre el tiempo que duran las generaciones, de forma que los estados de anhidrobiosis durante el ciclo vital podrían tener consecuencias significativas sobre la evolución de estos organismos, lo que conferiría a este carácter el grado de adaptación evolutiva y su evolución se produciría como consecuencia de la selección natural (Jönsson, 2001). El aumento de la longevidad en los tardígrados criptobiontes tendría impacto en la deriva y la selección a lo largo del tiempo, pero también es posible que facilitase el flujo genético por la dispersión local entre poblaciones adyacentes (Wright, 2001). Aceptando que el antecesor de los tardígrados provenía del mar, los primeros tardígrados que pudieron adquirir la capacidad de entrar en criptobiosis serían aquellos que se encontraban en el litoral marino, que sufrían períodos de sequía temporales. En este tipo de hábitats se encuentran actualmente las especies marinas Echiniscoides sigismundi y Archechiniscus marci que toleran períodos cortos de sequía (Jönsson, 2001).
Además de una protección contra la desecación y la congelación en estado natural, la anhidrobiosis les permite resistir condiciones extremas no naturales, como las inducidas experimentalmente (Jönsson y Bertolani, 2001), probablemente consecuencia de la ausencia de metabolismo y de la fase acuosa (Wright et al., 1992), que les matarían si no estuvieran en estado de criptobiosis (Ramløv y Westh, 2001). En este estado son capaces de soportar temperaturas que van desde los 150ºC a casi el cero absoluto, son resistentes al CO2 y al H2S (Crowe, 1971), altos niveles de vacío, radiaciones de rayos X y rayos ultravioletas hasta 1.140 veces la dosis letal para el ser humano (LD50 = 500 roentgens, para los tardígrados 570.000 roentgens; May, Maria y Guimard, 1964), y presiones hasta 6 veces la presión que hay a 10.000 metros de profundidad (es decir, hasta 600 MPa), también soportan su mantenimiento a estas altas presiones y a su descompresión a altas velocidades (a 30 MPa no hay ni proliferación ni metabolismo, y a 300 MPa la mayoría de las bacterias y de los organismos multicelulares mueren; Nelson, 1995; Seki y Toyoshima, 1998). También son capaces de soportar alcoholes de distintas polaridades, de hecho hay una correlación negativa entre la polaridad del alcohol a la que se somete el tardígrado y la supervivencia de éste (Ramløvy Westh, 2001).
Criptobiosis y Biomedicina
El animal cesa de envejecer durante la criptobiosis, por lo que el descubrimiento de los mecanismos involucrados en este fenómeno pueden proporcionar indicios sobre el proceso de envejecimiento en otros organismos, incluido el hombre (Nelson, 1995). La criopreservación de células es muy importante para el desarrollo de herramientas terapéuticas en la medicina clínica (Eroglu et al., 2000), la industria y la agricultura (Crowe y Crowe, 2000). Hasta ahora se habían utilizado sustancias crioprotectoras como dimetil sulfóxido [(CH3)2SO], glicerol y etilén glicol. Sin embargo, se han descubierto azúcares carbohidratados pequeños, como la trehalosa, la sacarosa y la maltosa, que tienen la capacidad de estabilizar y preservar proteínas, virus, bacterias y otros organismos (Eroglu et al., 2000). El principal problema a este respecto es cómo introducir la trehalosa en las células de mamíferos y, más en concreto, de humanos, para almacenarlas congeladas o desecadas (Crowe y Crowe, 2000; Eroglu et al., 2000). Actualmente se está tratando de resolver este punto utilizando, mediante ingeniería genética, bacterias y virus que introduzcan la trehalosa en la célula (Eroglu et al., 2000; Guo et al., 2000). La principal ventaja de la trehalosa es que al sustituir la capa de agua, que hay alrededor de las macromoléculas, previene el posible daño durante la desecación (Guo et al., 2000), ya que aumenta la viscosidad citosólica y disminuye el crecimiento de cristales de hielo intracelular, que resultarían letales (Crowe y Crowe, 2000). Respecto a los lípidos de las membranas, la trehalosa puede disminuir la fase de temperatura de transición de las membranas de manera que permanezcan en el estado de líquido-cristal durante la desecación, lo que estabiliza la membrana (Crowe y Crowe, 2000). En cuanto a las proteínas, la trehalosa inhibe la desnaturalización (Crowe y Crowe, 2000), al sustituir el agua de la superficie de la proteína. También inhibe la agregación de proteínas y preserva su estructura, probablemente reemplazando las moléculas de agua que mantienen el correcto plegamiento de las proteínas (Guo et al., 2000). El estudio de la aplicación de la trehalosa se basa en investigaciones básicas sobre la criptobiosis de organismos tales como las levaduras o los tardígrados, en una inesperada aplicación biotecnológica (Crowe y Crowe, 2000).